Иоланта ощущает необъяснимую тоску и ищет утешения в беседе с кормилицей Мартой. Её подруги, Бригитта и Лаура, стараются развеселить её песнями и цветами. Марта поет Иоланте любимую колыбельную, под которую та засыпает.
Прибывает Альмерик, оруженосец короля Рене, с известием о прибытии короля и знаменитого врача Эбн-Хакиа, который должен исцелить Иоланту. Король Рене объясняет врачу, что Иоланта с детства обручена с герцогом Робертом, но ни он, ни Иоланта не знают о её слепоте. Эбн-Хакиа утверждает, что исцеление возможно только если Иоланта сама страстно захочет прозреть.
Герцог Роберт и граф Водемон, заблудившись, находят сад Иоланты. Роберт, размышляя о своей возлюбленной Матильде, не хочет жениться на Иоланте. Водемон, увидев Иоланту, поражён её красотой. Он просит у неё красную розу, но Иоланта дважды даёт ему белую розу. Водемон понимает, что Иоланта слепа, и говорит ей о зрении и свете, но она утверждает, что красоту мира можно чувствовать и без зрения.
Появляется король Рене с врачом и прислугой. Рене в ужасе узнает, что Водемон открыл Иоланте её слепоту. В отчаянии он предлагает ей лечение Эбн-Хакиа, но Иоланта не выказывает желания прозреть. Тогда король угрожает казнить Водемона, если Иоланта не прозреет. Испуганная Иоланта умоляет врача исцелить её, чтобы спасти Водемона.
Появляется Роберт, готовый спасти друга. Водемон признаётся в любви к Иоланте и просит Роберта рассказать королю о своей любви к другой. Король Рене соглашается на брак Иоланты и Водемона. Иоланта прозревает, и все в горячей молитве благодарят Бога за её исцеление.